Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction)
DNA secara alami di dalam kromosom memang memiliki kemampuan untuk menggandakan diri (mereplikasi) secara sangat tepat. Proses replikasi DNA ini terjadi pada saat interfase dalam proses penggandaan sel. Pada proses replikasi akan dihasilkan rantai DNA baru dari rantai DNA yang telah ada. Proses replikasi dimulai dengan membukanya rantai ganda polinukleotida, kemudian pada setiap bekas rantai polinukleotida lama akan terbentuk rantai polinukleotida baru pasangannya. Pada akhir replikasi diperoleh dua DNA yang tepat sama masing-masing terdiri atas rantai polinukleotida lama dan baru yang saling melilit. Dalam proses tersebut diperlukan bahan berupa ATP, enzim DNA polimerase, enzim ligase, enzim helikase, dan deoksiribonukleosida. Proses inilah yang ditiru dalam metode PCR (Polymerase Change Reaction).
Berikut adalah komposisi campuran dalam proses PCR
Cetakan DNA
Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1.000 pasangan basa (bp) atau 1 kb. Hasil amplifikasi yang efisien adalah antara 100-400 bp. Walupun kemungkinan hasil amplifikasi dapat mencapai lebih dari 1 kb, tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang terlalu panjang rentang terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja enzim Taq DNA Polimerase, dan waktu yang diperlukan tentunya akan lebih lama. Hal ini dapat menyebabkan diperolehnya hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.
Kemurnian DNA target sangat penting, karena dapat mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja enzim Taq DNA Polimerase. Cetakan DNA yang terkontaminasi dengan sisa-sisa zat saat proses isolasi (seperti Lisis Buffer, ethanol, sisa debris sel) akan sulit teramplifikasi. Cetakan DNA juga tidak boleh terkontaminasi dengan DNA organisme lain yang selain organisme target, karena akan membiaskan hasil PCR dan pembacaan pada proses Sequencing nantinya.
Selain itu, juga perlu memperhatikan konsentrasi cetakan DNA. Konsentrasi cetakan DNA yang terlalu tinggi biasanya sulit diamplifikasi, ditandai dengan hasil elektroforesis yang menghasilkan pita yang smir. Bila konsentrasinya terlalu tinggi sebaiknya diencerkan dengan Elution Buffer atau ddH2O, dan saat isolasi DNA selanjutnya kurangi jaringan yang digunakan.
Primer
Primer tersusun atas urutan nukleotida, yang disinthesis berdasarkan urutan tertentu sesuai keinginan dengan mengikuti beberapa kriteria. Primer disusun dari urutan oligonukleotida sepanjang 15-32 bp pada ujung-5’ pita DNA cetakan maupun komplemennya. Primer terdiri dari dua pasang, biasanya disebut dengan Primer Forwad dan Primer Reverse.
Suhu annealing sangat tergantung pada primer dengan Tm tertentu. Baik Primer Forwad maupun Primer Reverse memiliki Tm sendiri-sendiri. Suhu annealing pasangan primer diperoleh dari rata-rata Tm Primer Forwad dan Tm Primer Reverse.
Penentuan Tm primer ditentukan secara teoritekal oleh Tm asam nukleat. Berikut rumus standar penentuan Tm:
Tm = 81,5 + 16,6 x (log10[NA+]) + 0,41 x 9% G + C) 675/n
[NA+] adalah konsentrasi molar garam
n adalah jumlah basa dalam oligonukleotida
Desain dan kualitas Primer memiliki efek yang signifikan dalam keberhasilan proses PCR. Hindari desain primer yang mengandung formasi dimer. Sebaiknya selisih Tm antara primer forwad dan primer reverse tidak terlalu jauh, yakni pada selang 55-60 OC.
Konsentrasi primer yang umumnya digunakan adalah 0,5 µM, akan tetapi konsentrasi primer dapat dioptimasi pada selang anatara 0,1 – 1 µM untuk keperluan tertentu, ini disesuaikan dengan kondisi DNA organisme yang akan dianalisis.
Taq DNA polimerase
Taq DNA Polimerase merupakan enzim ini bersifat thermostabil. Enzim ini sangat diperlukan dalam proses PCR. Taq DNA Polimerase diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas polimerisasi DNA dari ujung-5’ ke ujung-3’, dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada suhu 95OC. Biasanya setiap 100 µL volume reaksi, ditambahkan 2,0-2,5 µL unit Taq DNA Polimerase. Penggunaan enzim ini harus memperhatikan proses penyimpanan (selalu di freezer pada suhu -20OC), dan pada saat penggunaan tidak boleh terlalu lama pada suhu ruang, usahakan selalu berada pada kotak es (chiller) atau blue ice. Hal ini untuk meminimalkan kerusakan enzim Taq DNA Polimerase akibat perubahan suhu.
Taq DNA polimerase yang digunakan dalam PCR merupakan paten asli dari perusahan Promega, namun saat ini telah banyak dikembangkan oleh perusahaan lain.
Buffer PCR dan konsentrasi Mg2+
Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50 mM KCl, 10 mM Tris Cl (pH 8,3), dan 1,5 mM MgCl2. Buffer standar ini akan bekeja dengan baik untuk cetakan DNA dan primer dengan kondisi tertentu,mungkin tidak optimal dengan kombinasi yang lain. Produk buffer PCR ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.
Konsentrasi ion magnesium dalam buffer PCR merupakan faktor yang sangat esensial, karena dapat mempengaruhi proses annealing primer, suhu disosiasi untai cetakan DNA, dan produk PCR. Hal ini disebabkan oleh konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi sampel DNA yang tidak mengandung konsentrasi cheating agent yang tinggi, seperti EDTA atau fosfat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada biasanya tidak akan menghasilkan produk PCR, sedangkan bila terlalu tinggi akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan. Biasana ditandai dengan hasil elektroforesis pada ag
arose yang multiband.
Nukleotida (dNTP)
Konsentrasi yaqng biasa digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 µM. Penting untuk mengatur konsentrasi dNTP pada titik estimasi Km yaitu untuk setiap 50 mM dNTP, harus selalu diatur pH 7,0. Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim Taq DNA Polimerase, sedangkan pada konsentrasi yang rendah akan menimbulkan ketepatan dan spesifisitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan mengubah secara bebas.
Mesin PCR
Pertama kali dikembangkan oleh perusahan PerkinElmer sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR dari berbagai perusahan yang bergerak dibidang bioteknologi. Walupun nama dan mereknya berbeda-beda, akan tetapi fungsi dan prinsip kerjanya sama.
Alat ini secara tepat meregulasi suhu dan siklus waktu yang dibutuhkan untuk reproduksibilatas dan keakuratan reaksi amplifikasi. Siklus PCR terbagi atas tiga langkah utama yaitu denaturasi DNA (92-95OC, selama 30-60 detik), primer annealing (50-62OC, selama 30-60 detik), dan ekstensi (70-72OC, selama 30-120 detik). Siklus ini berulang 30-35 kali. Siklus utama terlebih dahulu diawali dengan denaturasi awal misalnya 94OC selama 5 menit. Langkah ini dilakukan untuk memaksimalkan proses denaturasi cetakan DNA, karena apabila denaturasi tidak sempurna akan menyebabkan kegagalan proses PCR. Setelah siklus utama beerakhir, ditutup dengan ekstensi final dengan suhu 70-72OC selama 7-10 menit.
 |
| Tampilan pada layar mesin PCR yang sedang bekerja |
Berikut adalah komposisi campuran dalam proses PCR
Cetakan DNA
Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1.000 pasangan basa (bp) atau 1 kb. Hasil amplifikasi yang efisien adalah antara 100-400 bp. Walupun kemungkinan hasil amplifikasi dapat mencapai lebih dari 1 kb, tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang terlalu panjang rentang terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja enzim Taq DNA Polimerase, dan waktu yang diperlukan tentunya akan lebih lama. Hal ini dapat menyebabkan diperolehnya hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.
Kemurnian DNA target sangat penting, karena dapat mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja enzim Taq DNA Polimerase. Cetakan DNA yang terkontaminasi dengan sisa-sisa zat saat proses isolasi (seperti Lisis Buffer, ethanol, sisa debris sel) akan sulit teramplifikasi. Cetakan DNA juga tidak boleh terkontaminasi dengan DNA organisme lain yang selain organisme target, karena akan membiaskan hasil PCR dan pembacaan pada proses Sequencing nantinya.
Selain itu, juga perlu memperhatikan konsentrasi cetakan DNA. Konsentrasi cetakan DNA yang terlalu tinggi biasanya sulit diamplifikasi, ditandai dengan hasil elektroforesis yang menghasilkan pita yang smir. Bila konsentrasinya terlalu tinggi sebaiknya diencerkan dengan Elution Buffer atau ddH2O, dan saat isolasi DNA selanjutnya kurangi jaringan yang digunakan.
Primer
Primer tersusun atas urutan nukleotida, yang disinthesis berdasarkan urutan tertentu sesuai keinginan dengan mengikuti beberapa kriteria. Primer disusun dari urutan oligonukleotida sepanjang 15-32 bp pada ujung-5’ pita DNA cetakan maupun komplemennya. Primer terdiri dari dua pasang, biasanya disebut dengan Primer Forwad dan Primer Reverse.
Suhu annealing sangat tergantung pada primer dengan Tm tertentu. Baik Primer Forwad maupun Primer Reverse memiliki Tm sendiri-sendiri. Suhu annealing pasangan primer diperoleh dari rata-rata Tm Primer Forwad dan Tm Primer Reverse.
Penentuan Tm primer ditentukan secara teoritekal oleh Tm asam nukleat. Berikut rumus standar penentuan Tm:
Tm = 81,5 + 16,6 x (log10[NA+]) + 0,41 x 9% G + C) 675/n
[NA+] adalah konsentrasi molar garam
n adalah jumlah basa dalam oligonukleotida
Desain dan kualitas Primer memiliki efek yang signifikan dalam keberhasilan proses PCR. Hindari desain primer yang mengandung formasi dimer. Sebaiknya selisih Tm antara primer forwad dan primer reverse tidak terlalu jauh, yakni pada selang 55-60 OC.
Konsentrasi primer yang umumnya digunakan adalah 0,5 µM, akan tetapi konsentrasi primer dapat dioptimasi pada selang anatara 0,1 – 1 µM untuk keperluan tertentu, ini disesuaikan dengan kondisi DNA organisme yang akan dianalisis.
Taq DNA polimerase
Taq DNA Polimerase merupakan enzim ini bersifat thermostabil. Enzim ini sangat diperlukan dalam proses PCR. Taq DNA Polimerase diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas polimerisasi DNA dari ujung-5’ ke ujung-3’, dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada suhu 95OC. Biasanya setiap 100 µL volume reaksi, ditambahkan 2,0-2,5 µL unit Taq DNA Polimerase. Penggunaan enzim ini harus memperhatikan proses penyimpanan (selalu di freezer pada suhu -20OC), dan pada saat penggunaan tidak boleh terlalu lama pada suhu ruang, usahakan selalu berada pada kotak es (chiller) atau blue ice. Hal ini untuk meminimalkan kerusakan enzim Taq DNA Polimerase akibat perubahan suhu.
 |
| Persiapan bahan-bahan untuk memulai proses PCR |
Taq DNA polimerase yang digunakan dalam PCR merupakan paten asli dari perusahan Promega, namun saat ini telah banyak dikembangkan oleh perusahaan lain.
Buffer PCR dan konsentrasi Mg2+
Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50 mM KCl, 10 mM Tris Cl (pH 8,3), dan 1,5 mM MgCl2. Buffer standar ini akan bekeja dengan baik untuk cetakan DNA dan primer dengan kondisi tertentu,mungkin tidak optimal dengan kombinasi yang lain. Produk buffer PCR ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.
Konsentrasi ion magnesium dalam buffer PCR merupakan faktor yang sangat esensial, karena dapat mempengaruhi proses annealing primer, suhu disosiasi untai cetakan DNA, dan produk PCR. Hal ini disebabkan oleh konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi sampel DNA yang tidak mengandung konsentrasi cheating agent yang tinggi, seperti EDTA atau fosfat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada biasanya tidak akan menghasilkan produk PCR, sedangkan bila terlalu tinggi akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan. Biasana ditandai dengan hasil elektroforesis pada ag
arose yang multiband.
Nukleotida (dNTP)
Konsentrasi yaqng biasa digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 µM. Penting untuk mengatur konsentrasi dNTP pada titik estimasi Km yaitu untuk setiap 50 mM dNTP, harus selalu diatur pH 7,0. Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim Taq DNA Polimerase, sedangkan pada konsentrasi yang rendah akan menimbulkan ketepatan dan spesifisitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan mengubah secara bebas.
Mesin PCR
Pertama kali dikembangkan oleh perusahan PerkinElmer sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR dari berbagai perusahan yang bergerak dibidang bioteknologi. Walupun nama dan mereknya berbeda-beda, akan tetapi fungsi dan prinsip kerjanya sama.
Alat ini secara tepat meregulasi suhu dan siklus waktu yang dibutuhkan untuk reproduksibilatas dan keakuratan reaksi amplifikasi. Siklus PCR terbagi atas tiga langkah utama yaitu denaturasi DNA (92-95OC, selama 30-60 detik), primer annealing (50-62OC, selama 30-60 detik), dan ekstensi (70-72OC, selama 30-120 detik). Siklus ini berulang 30-35 kali. Siklus utama terlebih dahulu diawali dengan denaturasi awal misalnya 94OC selama 5 menit. Langkah ini dilakukan untuk memaksimalkan proses denaturasi cetakan DNA, karena apabila denaturasi tidak sempurna akan menyebabkan kegagalan proses PCR. Setelah siklus utama beerakhir, ditutup dengan ekstensi final dengan suhu 70-72OC selama 7-10 menit.
No comments